青黴素過敏反應是由於抗原與抗體在致敏細胞上的相互作用而引起的。當青黴素配置一段時間再使用時，青黴素即可溶解在水溶液中並很快分解，經過分子重排形成青黴烯酸。
預防過敏，主要是用藥前，必須瞭解病人既往有無青黴素過敏史，如有，則決不能使用,如無過敏史，則此次注射應按照規定劑量作面板試驗(常用的青黴素皮試液每毫升內含藥100-1000單位，用0.1毫克作皮內試驗，即皮內注入10-100單位青黴素)，20分鐘後，如區域性出現紅腫並有偽足，腫塊直徑大於1釐米時為陽性反應，即不應注射。如陰性，則可予注射。 當注射完畢後，病人不應立即離開，觀察10幾分鐘無反應後再走。連續用後停藥，通常24小時後繼續用藥，建議重新做皮試。
青黴素是治療許多細菌性新形勢下有效藥，但較易發生過敏反應。對過敏的人不論任何給藥途徑(注射、口服、外用)、任何劑量、任何製劑(鉀鹽、鈉鹽、長效、半合成青黴素)，只要接觸本藥後均可發生過敏反應。過敏反應的發生率達3%~6%，可發生於任何年齡組，但以青壯年為多見。多數發生於多次接受青黴素治療的患者，偶爾也見於初次用藥的患者。
因此，在使用各種劑型的青黴素都應先做過敏試驗，試驗結果陰性者才能給藥，停藥到病除24小時以上需再次使用者或使用更換的青黴素時，需重新做面板過敏試驗。已知患者有過敏史，禁忌再做過敏試驗，試驗陽性禁用青黴素，並應在病歷、醫囑單、床頭卡上註明“青黴素陽性”，還要告訴患者及家屬。